摘要：簡單的說，PCR*是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)InVitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。

PCR簡介

PCR的要素

基本的PCR須具備

1.要被復(fù)制的DNA模板 Template

2.界定復(fù)制范圍兩端的引物Primers.

3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

4.合成的原料(四種脫氧核苷酸)及水。

PCR儀工作原理

利用升溫使DNA變性，用限制性內(nèi)切酶使DNA雙鏈解鏈，在聚合酶的作用下使單鏈復(fù)制成雙鏈，進而達到基因復(fù)制的目的

PCR的反應(yīng)包括三個主要步驟

分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱(至90~95℃)變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60℃)附著于模板DNA兩端。 *后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75℃)進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。

PCR的*早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年*早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

PCR的實現(xiàn)

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制

PCR的改進與完善

Mullis*初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：

①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。

②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物學界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：

①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。

②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。

③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

PCR儀的分類

普通的PCR儀

把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，叫傳統(tǒng)的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運行。主要是做簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。該儀器主要應(yīng)用于科研研究，教學，學臨床，檢驗檢疫等機構(gòu)。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常有12種溫度梯度，這樣的儀器*叫梯度PCR儀。因為被擴增的不同DNA片段，其*適退火溫度事不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增，*可以篩選出表達量高的*適退火溫度，進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。主要用于科研，教學機構(gòu)。梯度PCR儀，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。

原位PCR儀

用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀，如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內(nèi)的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，又能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實用價值。

實時熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，*成了熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同，只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出。把這PCR儀叫做實時熒光定量PCR儀(qPCR儀)。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于學臨床檢測，生物藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構(gòu)。

獲得諾貝爾獎的PCR技術(shù)

1995年，美國科學家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學獎，他所取得的成*是發(fā)明了PCR技術(shù)。

PCR，中文譯為聚合酶鏈式反應(yīng)，其實是一種DNA的快速擴增技術(shù)，其擴增效率之高*象核裂變的“鏈式反應(yīng)”那樣。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的 DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術(shù)一問世，立刻引起了分子生物學研究的一場革命，人們利用 這種轟動全的技術(shù)很快*把微觀領(lǐng)域的生物學研究大大地往前推了一步?？梢赃@么說，PCR技術(shù)使分子生物學研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術(shù)的 日趨完善，PCR在人類社會生活中的應(yīng)用也越來越廣泛。比如說在“DNA指紋” 中我們提到，科學家們只需要一根頭發(fā)甚至一個細胞*可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實際上*要采用PCR技術(shù)，因為一個細胞中的DNA含量實在太少 了，人們根本不可能檢測到它的指紋;有了PCR技術(shù)*好辦了，通過PCR技術(shù)把這個細胞中的DNA片斷擴增1000萬倍，這樣DNA量*足夠作指紋鑒定了。 再比如，在院里檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少(例如有的艾滋病病毒攜帶者)，通過傳統(tǒng)的檢查方法費力又費時，這時PCR技術(shù)也許*可以幫上忙。 可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設(shè)計合適的引物DNA，然后通過PCR技術(shù)一擴增很快*可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的 話，那么*說明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時一次做近百個擴增反應(yīng)，省時省力效率高。

PCR技術(shù)神奇*神奇在以下幾個特點上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個分子*可以用于擴增了;二是擴 增效率高，目的基因的量成指數(shù)形式擴增，幾個小時*擴增1000萬倍以上?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學研究、食品衛(wèi)生、療、法及環(huán)境監(jiān) 測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術(shù)!

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